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Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Mariol et al., A Rapid Protocol for integrating Extrachromosomal Arrays with high transmission rate into the C. elegans Genome, J. Vis. exp.(2013).
>1. UV-Bestrahlung und Rückgewinnung von transgenen Würmern
- Bestrahlung durch Würmer:
- Entnehmen Sie 30-100 fluoreszierende transgene L4-Tiere auf separate Kulturplatten (15-20 Tiere pro Platte).
- Legen Sie die Platten mit abgenommenen Deckeln in einen UV-Vernetzer. Bestrahlen Sie die Würmer mit 0,012 J/cm2. Beachten Sie, dass die Stämme mehr oder weniger empfindlich auf UV-Strahlung reagieren und dass die Ergebnisse je nach verwendetem UV-Strahler unterschiedlich sein können. Es kann ein Dosisbereich zwischen 0,010-0,015 J/cm2 getestet werden.
- Rückgewinnung von Würmern nach Bestrahlung:
- Stellen Sie die Platten mit bestrahlten Würmern über Nacht bei 15 °C zur Wiederherstellung auf.
- Überprüfe, wie viele Tiere am Leben sind. In unseren Händen ist eine Überlebensrate von etwa 80-90% für eine effiziente Bestrahlung angepasst.
- Die bestrahlten Tiere werden bei 15-25 °C gezüchtet, bis die Nachkommen das Entwicklungsstadium erreicht haben, das die Beobachtung der Co-Injektionsmarker-Expression ermöglicht.
>2. Isolierung von integrierten transgenen Linien
- Auswahl an F1-Tieren:
- Einzelne 150-200 fluoreszierende F1-Tiere auf separate Kulturplatten auffüllen. Für hochstrahlende Leitungen (≥80%) reichen 100 F1-Tiere aus.
- Halten Sie diese F1-Platten bei 15-25 °C, bis die Nachkommen ein geeignetes Stadium für die Beobachtung von fluoreszierenden F2-Tieren erreicht haben.
- Verwerfen Sie alle F1-Platten, die entweder i) keine Nachkommen aufweisen, was darauf hindeutet, dass das F1-Tier steril war oder gestorben ist, oder ii) keine oder nur wenige fluoreszierende F2-Tiere, was darauf hindeutet, dass das F1-Tier das Transgen nicht mit der erwarteten Rate übertragen hat. Dieser Schritt ist schnell und stellt einen echten Vorteil im Vergleich zum Standardprotokoll dar, das eine Schätzung des Prozentsatzes fluoreszierender F2-Würmer erfordert, um F1-Platten mit ≥75% fluoreszierenden Nachkommen auszuwählen (Tabelle 1).
- Auswahl an F2-Tieren:
- Einzeln vier fluoreszierende transgene F2-Tiere aus jeder ausgewählten F1-Platte. Wenn Sie fluoreszierende Transgene (z. B. mCherry, gfp oder dsRed) verwenden, wählen Sie F2-Würmer mit einem hohen Fluoreszenzgrad, da dies darauf hindeuten könnte, dass diese Tiere homozygot für das integrierte Array sind. Beachten Sie, dass es bei der Auswahl von F2-Tieren wichtig ist, keine Eier oder Larven mit sich zu führen, um falsch negative Ergebnisse im nächsten Schritt zu vermeiden.
- Züchten Sie F2-Tiere bei 15-25 °C.
- Isolierung und Validierung von integrierten transgenen Stämmen:
- Sieb F2-Platten auf 100% fluoreszierende transgene F3-Würmer. Das Sieb ist recht schnell, da das Vorhandensein eines einzelnen nicht fluoreszierenden Wurms darauf hinweist, dass die Platte weggeworfen werden sollte. Ein F2-Tier, das homozygot für das integrierte Transgen ist, ergibt 100% homozygote fluoreszierende Nachkommen.
- Einzelne acht fluoreszierende F3-Tiere aus ausgewählten Platten, um die 100%ige Vererbung des Transgens zu bestätigen. Theoretisch reicht es in diesem Schritt aus, ein Tier auszuwählen. Die Auswahl von acht fluoreszierenden F3-Tieren kann jedoch notwendig sein, um die Selektion unfruchtbarer oder ungesunder Tiere zu vermeiden, da die Bestrahlung zufällig Mutationen induzieren kann, die Gene betreffen, die für die Physiologie des Wurms wichtig sind.
- Wenn möglich, sollten mehrere unabhängige integrierte transgene Stämme gehalten werden, d. h. Stämme, die von verschiedenen F1-Tieren stammen.
